Métodos Sorológicos Diagnóstico e Pesquisa
Noções Básicas em Coleta de Sangue e Hemoterapia
1 Testes sorológicos
-Uso de soro ou outros fluidos biológicos de paciente p/ diagnóstico laboratorial.
- Demonstração de anticorpos específicos = diagnóstico presuntivo (indireto).
- Demonstração de agente infeccioso ou antígeno do agente = diagnóstico diret.
Vantagens dos testes sorológicos
- Rapidez.
- Simplicidade.
- Possibilidade de automação.
- Armazenamento de material biológico.
- Baixo custo operacional.
- Oferta de kits comerciais padronizados.
Aplicações dos testes sorológicos:
1 – Diagnóstico presuntivo e diferencial.
2 – Diferenciação de fases da doença.
3 – Diagnóstico de alergias.
4 – Diagnóstico de doenças autoimunes.
5 – Diagnóstico de imunodeficiências congênitas.
6 – Seleção de doadores de sangue.
7 – Seleção de doadores de órgãos para enxertos.
8 – Dosagens hormonais.
9 - Prognóstico da doença.
10 – Avaliação da eficácia da terapêutica instituída.
11 – Avaliação da imunidade específica (vacinação).
12 – Pesquisa de antígenos em células ou tecidos.
13 – Pesquisas epidemiológicas.
14 - Pesquisa básica e aplicada.
2 Áreas de conhecimento que utilizam métodos sorológicos
- Imunologia.
- Patologia.
- Alergologia.
- Microbiologia (bact., vírus, fungos).
- Morfologia.
- Hematologia.
- Endocrinologia.
- Oncologia.
Forças de ligação envolvidas nas reações:
- Conjunto de reações fracas que estabilizam a ligação entre moléculas de antígenos e de anticorpos:
- Pontes de hidrogênio.
- Ligações iônicas.
- Forças hidrofóbicas.
- Forças de Van der Waals.
Fatores que interferem na ligação entre Ag e Ac
- Especificidade dos anticorpos.
- Afinidade dos Ac.
- Avidez dos Ac.
- Concentração dos Ac e antígenos.
- Classe dos anticorpos envolvidos.
- Pureza dos antígenos utilizados.
3 Afinidade x avidez
- Afinidade: Força de ligação resultante do total de forças não-covalentes entre um único sítio de ligação do Ac e um único epítopo do antígeno. Depende do grau de complementariedade entre as duas moléculas.
- Ac de baixa afinidade baixa afinidade ligam-se de modo se de modo fraco e tendem a se dissociar com facilidade. Ac de alta afinidade estabelecem ligações fortes e mais duradouras.
- Avidez: Força resultante de interações múltiplas entre uma molécula de anticorpo e os epítopos de um antígeno complexo. Quanto mais sítios de ligação tiver um anticorpo (ex. Fragmento Fab
- Em geral quanto maior a avidez, melhor seu efeito biológico final (ex. reconhecimento de antíegos complexos sobre a superfície de Afinidade x avidez patógenos)
- A baixa afinidade de um Ac pode ser compensada por sua elevada avidez.
Fatores que interferem na ligação entre Ag e Ac
- Concentração dos anticorpos (equilíbrio entre concentração de Ag e Ac).
- pH do meio de reação.
- Temperatura de reação.
- Tempo de reação.
Equilíbrio de concentração de Ag e Ac:
-Concentração dos anticorpos (equilíbrio entre concentração de Ag e Ac).
- pH do meio de reação: pH ácido=desfaz reação.
- Temperatura de reação: em geral o aumento de temperatura torna a reação mais rápida. Cuidado: não deixar denaturar os componentes da reação. Reações com complemento devem ser à baixa temperatura.
- Tempo de reação: Quanto maior o tempo, mais fortes as ligações Ag-Ac e maior a probabilidade de dar reação positiva. Algumas reações ocorrem em minutos, outros requerem muitas horas. Em geral dependem da quantidade de reagentes usados na reação.
Conceitos básicos em sorologia
- Título.
- Teste de referência.
- Sensibilidade.
- Especificidade.
- Falso.
- positivo, falso positivo, falso.
- negativo negativo.
- Reação cruzada.
- Precisão.
- Acurácia ou exatidão.
- Reprodutibilidade.
- Limiar de reatividade (cut off).
Título
- Título de uma soro ou solução de anticorpos (Igs), refere-se à máxima diluição na qual um teste continuando dando reação positiva.
- Por exemplo, quando dizemos que um soro deu título de 1:5000 para toxoplasmose, significa que mesmo diluindo-se a amostra 5000 vezes, a reação continua positiva.
- Uma mesma amostra pode ter título de 1:100 em um tipo de teste (por exemplo no teste de precipitação) e título de 1:10.000 em outro teste (por exemplo ELISA). Isso dependerá do limiar de detecção de cada ensaio.
4 Teste de referência
- Teste já conhecido e usado para um determinado propósito, com o qual uma nova metodologia deve ser comparada durante sua padronização. São chamados também de padrão
-ouro.
- Por exemplo, qualquer teste sorológico proposto para o diagnóstico da doença de Chagas, deve ser comparado com o xenodiagnóstico, baseado na demonstração de que o paciente tem o parasita circulante.
Sensibilidade de um teste sorológico
- A sensibilidade de um teste sorológico refere-se à percentagem de resultados positivos na população sabidamente doente, isto é, a proporção de resultados positivos verdadeiros.
- Resultado falso-positivo = refere-se a reações Sensibilidade de um teste sorológico.
- Resultado falso-positivo = refere-se a reações positivas em indivíduos sabidamente sadios.
- O termo sensibilidade é também usado para definir o limiar de detecção de um método, isto
é, a quantidade mínima de Ac detectável.
Especificidade de um teste sorológico
- A especificidade é definida pela percentagem de resultados negativos em pacientes sabidamente sadios, isto é, à
proporção de resultados negativos verdadeiros. Em outras palavras, um teste com alta especificidade fornece poucos dados falso-positivos.
- Resultados falso-negativos: corresponde às reações negativas em pacientes sabidamente doentes.
Reação-cruzada
- Uma reação cruzada é resultado da similaridade tridimensional entre duas moléculas de antígenos diferentes.
- Assim, um Ac gerado contra uma das moléculas pode reagir com a outra, ainda que sua afinidade seja mais baixa.
- Um exemplo prático das reações cruzadas é a que se observa entre alguns anticorpos contra leishmania que reagem cruzadamente com antígenos de tripanossomas.
Precisão
- Expressa a concordância dos resultados obtidos após várias repetições e traduz a possibilidade de erro acidental do método.
- Quanto maior a precisão do teste, menor a influência que sofre das condições de execução (temperatura, pH, manuseio, tempo, etc).
Exatidão ou acurácia
- Determina a capacidade do teste em fornecer resultados muito próximos ao verdadeiro valor do que está sendo medido. Detecta erro do sistema ou tendência de desvio.
Reprodutibilidade
- Refere-se à obtenção de resultados iguais em testes realizados com a mesma amostra, por pessoas diferentes em locais diferentes.
Limiar de reatividade (“cut off”)
O limiar de reatividade ou cut off de um teste é entendido como o ponto de corte de um teste, isto é, o valor acima do qual se deverá considerar o resultado como positivo.
- A rigor, não existe um teste sorológico que estabeleça claramente o que é um resultado positivo e um negativo, pois sempre existem amostras cujos resultados ficam em uma zona “duvidosa”.
Antígenos solúveis e antígenos particulados
Reações com antígenos Solúveis:
- Precipitação em gel.
- Precipitação em meio líquido.
- ELISA.
- Radio imunoensaio.
- Quimioluminescência.
- Western-blot.
- Reações com antígenos particulados:
- Hemaglutinação
- Aglutinação de látex Antígenos solúveis e antígenos particulados
- Imunofluorescência (citometria de fluxo)
- Imuno-histoquímica