Produção de semente

Ao material de propagação dos cogumelos referimo-nos, geralmente, com o termo semente.

A disponibilidade de semente de boa qualidade constitui um factor limitante para o cultivo de cogumelos em muitos países em vias de desenvolvimento. A importação é geralmente entravada pela burocracia alfandegária, os custos altos de transporte e a dificuldade de manter a semente refrigerada durante o transporte. Portanto, pode ser necessário que o produtor de cogumelos produza o seu próprio material de inoculação (semente).

O procedimento completo da produção de semente implica a preparação do meio de cultivo, o enchimento dos tubos de ensaio ou placas de Pétri, a sua esterilização, a inoculação com micélio e o processo de inoculação com esta cultura, de recipientes de maior dimensão.

No fundo, a produção de semente não é outra coisa que a colocação de micélio do cogumelo desejado em substratos apropriados, esterilizados, sob condições assépticas.

Contudo, na prática, a produção de semente não é tão fácil. As estirpes apropriadas das espécies de cogumelo requeridas devem ser mantidas sob condições rigorosas para prevenir a sua degeneração. Se isto não for possível, dever-se-á utilizar a cultura de tecidos de um cogumelo fresco e saudável para a produção de semente.

Para além disso, o processo completo de produção de semente requer o uso de normas higiénicas muito elevadas. Por conseguinte, o recinto da produção de semente deve ser mantido meticulosamente limpo para prevenir qualquer contaminação.

Figura 7: Desde a cultura de tecido até à produção de cogumelos – vários passos no processo do cultivo de cogumelos.

Os requisitos para uma unidade de produção de semente são, no mínimo:

• Equipamento de laboratório, como sejam placas de Pétri, tubos de ensaio, balança, álcool, chama
• Unidade de esterilização (panela de pressão, autoclave)
• Ambiente estéril: uma caixa de inoculação ou uma cabina com fluxo laminar do ar
• Recinto de incubação

O equipamento supramencionado encontra-se normalmente disponível em hospitais, estações experimentais e universidades.

As matérias-primas incluem:

• Ingredientes para a preparação dos meios de cultivo
• Cultura pura ou cogumelos frescos da estirpe desejada de certa espécie de cogumelo
• Recipientes para semente (como sejam garrafas ou sacos de plástico)

Um ambiente limpo é absolutamente essencial para a produção de semente. Particularmente, em situações em que se tenham que abrir os recipientes contendo meios de cultivo esterilizados, isto deve ser feito sob condições assépticas. O ar transporta numerosos contaminantes, que infectam facilmente os meios de cultivo esterilizados. Portanto, é necessário utilizar armários e recintos de inoculação especiais para efetuar o manuseamento e a preparação das culturas (de tecidos). (Ver o apêndice 2 para um teste sobre a qualidade do ar).

Figura 8: Armário simples, de construção caseira, apresentando um vidro dianteiro, que pode ser aberto, e orifícios (com mangas de pano) para manuseamento.

O interior dum recinto de inoculação deve ser fabricado de materiais que não são biologicamente degradáveis. Todas as superfícies devem ser lisas e fáceis de limpar. As prateleiras devem ser concebidas de tal maneira que o chão que se encontra por baixo delas possa ser limpo facilmente. Os materiais mais utilizados para o fabrico das prateleiras são o metal ou a fórmica. A luz UV, a ser acendida fora do horário laboral, ajudará a destruir os contaminantes.

Estes armários simples para inoculação são muito utilizados em todo o mundo. Podem ser construídos de forma barata com uso de materiais localmente disponíveis. Deve-se poder abrir o vidro dianteiro de modo a ser possível encher o armário com meios de cultivo esterilizados. O interior é desinfectado com uso de uma solução de 10 % de Clorox, ou uma solução de 2% de Formalin ou 70% de álcool etílico.

Um sistema de fluxo laminar do ar (LAF, Laminar Air Flow) é constituído por um ventilador, uma conduta de ar, um filtro HEPA (High Efficiency Particle Air /de Alta Eficiência para Partículas do Ar) e uma cobertura.

Os produtores classificam os ventiladores conforme o volume do ar que podem soprar através de materiais com resistência especificada. Uma velocidade do ar de, aproximadamente, 0,45 m/s é considerada a melhor para obter, de forma adequada, um fluxo laminar do ar.

O ventilador deve ser regulado de forma gradual e, para além disso, ter a capacidade de empurrar o dobro do volume do ar requerido através do filtro para atingir a velocidade necessária do ar, de forma a compensar perdas de pressão provocadas quando o filtro estiver cheio com partículas.

Ter em consideração que um bom armário de inoculação é, geralmente, melhor que um sistema LAF mal construído e colocado inadequadamente.

Os filtros e ventiladores formam o âmago de qualquer sistema com fluxo laminar do ar, mas há outros factores que também devem ser tomados em consideração: as capacidades e a higiene dos operadores do sistema, e a construção de condutas de ar e filtros, para assegurar que não seja possível que ar contaminado seja aspirado para dentro.

Figura 9: Um sistema de Fluxo Laminar do Ar (à esquerda) e um corte transversal do mesmo (à direita)

Os grãos de cereal, a serradura e o composto contêm grandes quantidades de contaminantes. Um único grão de cereal pode conter milhões de bactérias e fungos.

Um aquecimento de 20 minutos a 121 °C é geralmente suficiente para destruir todos os organismos. Dependendo da maneira que a unidade de esterilização/pasteurização é enchida e também da capacidade da fonte de aquecimento, leva bastante tempo até que, com um tal aquecimento utilizando o vapor, se possa atingir esta temperatura na parte central, interior, dos substratos.

A opção mais barata é obter uma ou mais panelas de pressão grandes. Escolher panelas de pressão que mantenham a pressão mesmo quando a temperatura extrema (final) tenha sido atingida.

Figura : Corte transversal duma panela de pressão para uso numa fonte de aquecimento (à esquerda) e uma panela eléctrica de pressão ou autoclave simples (à direita).

As panelas de pressão mais simples deixam sair vapor quando a pressão se torna demasiado alta. Neste caso, a pressão no interior descerá, geralmente, para abaixo de 1 atmosfera de sobrepressão, provocando a ebulição dos meios de cultivo.

A maioria das espécies desenvolvem-se nos seguintes meios de cultivo:

Meio de extracto de Batata-Dextrose-Ágar (BDA) (ver a Figura a seguir)

Ingredientes: 200 g de batata cortada em cubos, 20 g de pó de ágar, 20 g de dextrose ou açúcar branco comum, 1 litro de água.

• Lavar e pesar as batatas e cortá-las em pequenos pedaços.
• Fazer o cozimento durante 15 a 20 minutos até se tornarem moles.
• Retirar as batatas.
• Acrescentar água ao caldo até se obter exatamente 1 litro.
• Acrescentar a dextrose e o ágar. É necessário acrescentar a quantidade apropriada de açúcar e ágar, senão o meio de cultivo irá se tornar ou demasiadamente mole ou demasiadamente duro.
• Mexer, de vez em quando, e aquecer suavemente até o ágar se ter derretido. O ágar deve estar quente ao verter-se nos tubos de ensaio ou garrafas, senão ficará encaroçado.
• Encher, aproximadamente, um quarto dos tubos de ensaio.
• Em seguida, fechar os tubos ou as garrafas com tampões de algodão.

Depois de se encher os tubos de ensaio ou as garrafas com o meio de cultivo (ver a Figura a seguir, desenho 5), estes devem ser esterilizados (ver a Figura a seguir, desenho 6) antes de serem usados. As unidades de esterilização mais correntemente usadas em laboratórios de pequenas dimensões são as panelas de pressão, mas também é possível utilizar autoclaves.

• Deitar água numa panela de pressão até atingir o nível do suporte.
•  Colocar as garrafas ou os tubos de ensaio nos suportes, cobrindo-os com uma cobertura de plástico para prevenir que os tampões de algodão sejam humedecidos por água.
•  Depois, fechar bem a tampa.
• O orifício da saída de pressão deve estar aberto desde o começo do processo para permitir que o ar possa sair. Vai durar alguns minutos desde o momento de ebulição até à saída do vapor.
• Fechar o orifício da saída de pressão. O medidor de pressão mostra a subida da pressão.
•  Esterilizar sob pressão durante 20-30 minutos.
•  Não abrir o orifício da saída de pressão antes de a panela de pressão ter arrefecido completamente até à temperatura ambiente!
• Abrir a panela de pressão e retirar os tubos de ensaio ou as garrafas.

Não mover ou manusear os tubos de ensaio até o ágar se ter solidificado, de modo a prevenir que uma pequena parte do ágar solidifique do outro lado do slant ou demasiadamente perto do tampão de algodão.

Figura : Preparação do meio extracto de Batata-Dextrose-Ágar (BDA) (desenhos 1- 4). Enchimento (desenho 5) e esterilização dos ‘slants’ ou das garrafas numa panela de pressão (desenho 6).

Os primeiros passos da produção de semente são efetuados em meios de cultivo artificiais. Estes devem conter suficientes nutrientes, como sejam sacarídeos/ glícidos, para os cogumelos se desenvolverem e um agente solidificador (ágar ou gelatina). O micélio desenvolve-se na superfície do meio de cultivo e, mais tarde, será usado para inocular maiores quantidades de substrato, como sejam grãos de cereal. Podem-se utilizar tubos de ensaio ou placas de Pétri (ou garrafas achatadas de whisky) como recipientes de culturas.

Ver a figura a seguir:

1. A cultura inicial (ou cultura-mãe) pode ser obtida dum produtor de semente ou dum laboratório ou pode ser preparada utilizando-se um corpo de frutificação, fresco e saudável.
2. Preparam-se várias culturas de ágar com base na cultura inicial
3. Inoculam-se mais tubos de ensaio com uso dos métodos descritos para transferência de culturas (ver o Apêndice 4 para instruções detalhadas).
4. Estas servem para inocular recipientes de maior dimensão (p.ex. garrafas) com semente-mãe, que podem ser usadas para inocular o substrato para a semente final.

O micélio degenerar-se-á após um certo número de transferências, de forma que não é possível continuar-se, ilimitadamente, as transferências de culturas em ágar.

Figura : Multiplicação de culturas.

O micélio novo e vigoroso pode ser obtido a partir dum novo corpo de frutificação, com uso de um bisturi, álcool, amostras em posição inclinada (slants) esterilizadas de ágar, placas de Pétri ou garrafas com ágar, uma chama (sem fumo) e uma mesa limpa de trabalho ou, preferivelmente, um Armário com Fluxo Laminar do Ar ou uma caixa de inoculação.

Veja a Figura a seguir :

•  Lavar minuciosamente o cogumelo.
•  Mergulhar o bisturi em álcool e, depois, aquecer com chama até se tornar incandescente.
• Deixar arrefecer durante 10 segundos.
• Romper ou rasgar o cogumelo ao comprido (não cortar com faca, visto que contaminantes da superfície podem pegar-se à lâmina). Não tocar com as mãos o interior dos pedaços cortados.
• Usar o bisturi aquecido para remover um pequeno pedaço (2x2 mm é suficiente) do tecido interior. Ter cuidado para não incluir tecido da superfície exterior.
• Abrir o tubo de ensaio/placa de Pétri.
• (Ao usar tubos de ensaio: aquecer a boca do tubo na chama para destruir esporos não desejados). Depois, colocar suavemente o tecido, presente no bisturi, no centro do ágar.
• Meter imediatamente o tampão de algodão.
• Inocular, no mínimo, três culturas, mas preferivelmente ainda mais.

Incubar as placas de Pétri ou os slants de ágar recém-inoculados a 25 °C durante, aproximadamente, dez dias. Dentro de três a quatro dias, o micélio terá coberto o tecido e ter-se-á ramificado no ágar.

Figura : Preparação de uma cultura inicial a partir de tecido.

A semente-mãe pode ser usada para inocular a semente em grãos de cereal ou uma segunda geração de semente-mãe.

Figura : (Desenhos 1-5) Preparação de semente em grãos de cereal em garrafas de vidro. A boca da garrafa deve ser limpa (3) para prevenir a germinação de esporos. (Desenhos 6-14) Transferência de cultura /inoculação de um recipiente de vidro com semente-mãe. Incubação da semente (desenhos 14-16). Ampliação: O micélio está a desenvolver-se de forma a cobrir todo o substrato na garrafa.

Para Agaricus spp. e Volvariella spp. utiliza-se apenas semente em grãos de cereal. A vantagem principal de grãos de cereal é que são muito nutritivos para fungos e que formam facilmente grânulos. Os grânulos podem ser espalhados facilmente no substrato. A maior desvantagem é que fornece um substrato que também é óptimo para outros organismos. Portanto, o risco de contaminação é elevado.

Os grãos de cereal em pequenos recipientes podem ser humedecidos até atingirem um nível mais alto do que os grãos de cereal acondicionados em sacos de 15 litros. Para recipientes de 2 litros, usar a seguinte receita: 480 g de centeio, sorgo/mapira ou trigo, 400 ml de água, 2 g de gesso (45% de humidade). 

Substrato para semente em grãos de cereal: Grãos de cereal 10 kg, CaCo3 147,5 g, Farelo de arroz 1,25 g, Gesso 0,1475g, Ureia 0,5 g, Água 1,5 litro.

Podem-se utilizar diferentes tipos de grãos de cereal, como sejam trigo, centeio, milho miúdo/mexoeira, arroz ou sorgo/mapira. Primeiro cozer os grãos do cereal, escoá-los e depois encher os recipientes e esterilizá-los.

O teor de humidade dos grãos de cereal, quando cozidos, deve ser de, aproximadamente, 50%. Se for mais alto, o desenvolvimento micelial pode ser mais rápido, mas também o risco de bactérias que provocam a `mancha húmida’ se tornará mais elevado. Se for mais seco que 35%, o desenvolvimento micelial será bastante lento.

Esterilizar os recipientes para semente, numa autoclave. A duração depende da autoclave, da forma na qual os recipientes para semente estão colocados (juntos ou dispersos) e do tamanho dos recipientes.

Por exemplo, duas horas para recipientes de 500 g; três até quatro horas para sacos de 3 kg. Os recipientes para semente devem ter arrefecido adequadamente antes de os tirar da autoclave.

Quando a temperatura na parte central do recipiente tiver baixado até atingir a temperatura óptima para o desenvolvimento micelial, os recipientes para semente podem ser inoculados. Usar para cada garrafa, no mínimo, um (no caso de garrafas de 250 ml) ou dois (no caso de garrafas maiores) dos quadrados de 10 x 10 mm do ágar completamente coberto com a cultura-mãe.

Incubar as garrafas até o micélio se ter desenvolvido de forma a cobrir todo o substrato. A temperatura deve ser próxima da temperatura óptima para se obter um bom desenvolvimento micelial.

Guardar a semente no refrigerador e tirá-la apenas se for necessário.

Armazenamento e pureza

A semente de boa qualidade evidencia um desenvolvimento micelial vigoroso e não contém outros organismos. Se tiver sido armazenado durante demasiado tempo, tornar-se-á menos vigoroso.

De modo a inocular o composto nas prateleiras (ou o composto nos sacos de cultivo colocados no chão) utilizam-se maiores quantidades de semente, geralmente chamada semente final. De modo a preparar a semente final, podem-se usar sacos de plástico como recipientes para semente.

O procedimento para a semente final é parecido ao da preparação da semente-mãe. A única diferença é o tamanho dos recipientes.

Ver as duas figuras a seguir.

Figura : Esterilização de recipientes para semente num tambor de petróleo.

Figura : Quando o micélio estiver plenamente desenvolvido (ver o detalhe ampliado) o conteúdo dos sacos está pronto para a inoculação do composto nas camas de cultivo.

Na natureza os cogumelos saprófitos são capazes de obter os nutrientes de resíduos vegetais e madeira morta. Os cogumelos cultivados, como sejam as espécies Agaricus (Cogumelos Champignons) e as espécies Volvariella (Cogumelos de Palha de Arroz) apenas podem crescer em resíduos vegetais fermentados ou compostados. Ao processo da fermentação chama-se compostagem.

A compostagem é necessária para fazer com que as substâncias orgânicas mortas se tornem apropriadas para estes cogumelos se desenvolverem com uso das mesmas.

Por conseguinte, a compostagem é essencial para se obter:

Um meio seletivo de nutrientes (quer dizer, um meio de nutrientes que é muito apropriado para o micélio de cogumelos que queremos cultivar e menos apropriado para todo o tipo de bolores competitivos).

Um meio homogéneo de nutrientes com uma estrutura homogénea e um teor de humidade constante.

Resíduos agrícolas, como sejam palha de trigo, palha de arroz ou bagaço prensado de cana-de-açúcar são geralmente usados como materiais orgânicos básicos para a compostagem. Verificar as fontes disponíveis na região e fazer com que haja um fornecimento constante de materiais básicos de boa qualidade. A boa qualidade da palha implica que a palha esteja seca e que não esteja podre. Para se obter uma boa mistura, a palha não deve ser empilhada em feixes ou fardos, mas deve ser cortada até atingir um tamanho de meio metro.

Enquanto que a maioria da palha de trigo tem uma boa estrutura, a palha de arroz entope-se facilmente e fica congestionada quando está demasiadamente molhada. Para além disso, se as partículas de palha forem demasiadamente curtas, o ar não passará facilmente através delas. Por razões similares o feno de gramíneas secas é menos apropriado; logo que os materiais estejam molhados formarão torrões obstruindo o fluxo do ar no interior da pilha.

Figura : Empilhamento e revolvimento da pilha de composto. A temperatura no interior da pilha de composto não deve ser superior a 55°C, de forma a prevenir a perda de nutrientes valiosos.

No caso do bagaço, é importante que madureça no campo aberto antes de ser usado, de modo que os açúcares residuais sejam lixiviados pela chuva, prevenindo assim o desenvolvimento de fungos prejudiciais, que se alimentam destes açúcares.

Como fonte de proteínas, utiliza-se, muitas das vezes estrume de animais de estábulo, rico em palha. Normalmente, utiliza-se estrume de cavalos ou de galinhas mas também se pode empregar o estrume de outros animais. O estrume de galinhas tende a conter um teor de nutrientes mais elevado do que o estrume de cavalos ou de vacas e, muitas das vezes, ainda fica mais concentrado devido à secagem.

Se o estrume for escasso ou caso nem haja, também se pode empregar um estrume artificial, como seja a ureia. A par do estrume, acrescentase gesso ou giz. Para além disso, como em todos os processos induzidos por bactérias e fungos, a presença de água é imprescindível durante a compostagem.

Em última instância, mas não por isso menos importante: quando empilhados os materiais, o arejamento da pilha de materiais orgânicos constitui um procedimento importante. O arejamento é essencial para garantir uma decomposição adequada e para evitar processos anaeróbios indesejáveis e pestilentos. Por esta razão, o material orgânico deve ter uma boa estrutura. E também não deve estar demasiadamente compacto quando empilhado.

1000 kg de estrume de estábulo, rico em palha, ou palha misturada com estrume de galinhas, bem misturada com 10 kg de giz.

Acrescenta-se água até esta sair da pilha.

• 1000 kg de palha
• 10 kg de ureia
• 20 kg de sulfato de amónio
• 8 kg de sulfato de potássio
• 25 kg de carbonato de cálcio

Ao escolher um local para a compostagem, deve-se ter em consideração que o local não se deve encontrar na vizinhança de casas, de modo a evitar queixas devido ao mau cheiro. O local de compostagem também deve estar situado a certa distância dos recintos de cultivo e do laboratório.

Se o armazenamento de materiais básicos e a compostagem se realizarem na proximidade dos recintos de cultivo, as pragas e doenças poderão facilmente disseminar-se para estes recintos. Embora custe mais mão-de-obra e trabalho para se transportar o composto para os recintos de cultivo, terá como resultado obter uma maior higiene da exploração. Este esforço adicional de transporte é limitado em comparação com os riscos, custos e perdas devido a uma forte infestação da cultura provocada por negligência das regras básicas no que diz respeito à higiene da exploração.

A compostagem deve-se realizar, preferivelmente, numa placa de betão. Se for possível, a placa de betão deve ser construída de forma ligeiramente inclinada, com uma bacia cimentada no fundo de modo a recolher a água que se filtra do composto.

Os materiais são empilhados em pilhas de compostagem com dimensões estandardizadas; não têm uma altura superior a 1,5 m e têm lados direitos. No cultivo de cogumelos, as ditas dimensões mostraram ser os mais eficientes, garantindo uma decomposição adequada dos materiais utilizados.

Recomenda-se construir uma cobertura sobre a placa de betão de modo a prevenir que a pilha de composto se torne seca devido à luz do sol ou que fique ensopada por chuvas fortes.

Processo de compostagem

A compostagem é um processo de decomposição provocada por microrganismos, que leva a um substrato selectivo e rico em nutrientes, apropriado para os cogumelos que pretendemos cultivar. Adiante indicam-se as normas essenciais para se obter uma preparação de composto adequada.

Rega e pré-umedecimento

O material orgânico seco é empilhado e regado com água. É importante que a pilha seja mantida húmida mas não ensopada, de modo que não se lixiviem os nutrientes. Esta fase de pré-umedecimento levará, aproximadamente, 5-6 dias e, cada dia, acrescenta-se um pouco mais água. A prática do humedecimento deve amolecer a camada exterior da palha através da decomposição da sua camada de cera. Às vezes, o pré-humedecimento é levado a cabo pondo a palha de molho, durante alguns dias, numa bacia de água.

Depois da fase do pré-umedecimento, a palha e o estrume são misturados adequadamente e empilhados numa pilha com uma altura de 1,5 m. A parte interior da pilha não deve ser demasiadamente densa, de modo a facilitar um arejamento adequado.

A compostagem é um processo biológico que gera calor. Quando a compostagem se efetua de forma adequada, a temperatura pode subir até 60 ˚C. Uma pilha de composto bem fabricada produz alguma quantidade de vapor. Um método simples para medir a temperatura da pilha é o seguinte: meter a mão na pilha. Pode-se aguentar uma temperatura de 55 ˚C, de modo que dever-se-á retirar, rapidamente, a mão se a temperatura estiver mais elevada.

Quando da pilha de composto sai muito vapor e a temperatura é superior a 60/70 ˚C, a pilha está demasiadamente quente. Caso assim seja, recomenda-se baixar a temperatura revolvendo a pilha: a parte de dentro fica no lado de fora.

A taxa de decomposição é acelerada através do revolvimento e da mistura da pilha, realizados segundo intervalos.

• É necessário que a pilha seja revolvida frequentemente de modo a:
• Garantir uma decomposicão rápida e adequada
• Prevenir o seu sobreaquecimento
• Obter uma estrutura homogênea.

Quando se revolve pela primeira vez, acrescentar gesso e também fazer com que os torrões de estrume sejam quebrados e que o composto seja misturado adequadamente.

Um esquema básico de revolvimento implica o revolvimento da pilha depois de 5 dias e ainda mais 4 vezes, a intervalos de 3 dias. Fazer com que durante o revolvimento da pilha, a camada exterior do composto fique no interior da pilha nova e vice-versa.

Os processo biológicos, como seja a compostagem, precisam de água. Durante o processo completo da compostagem, o material do composto deve ser mantido húmido mas não tão molhado que haja uma fuga do líquido. Por outro lado, se o composto estiver demasiadamente seco, dever-se-á acrescentar água para obter um processo óptimo. Caso se utilize palha de arroz, dever-se-á prestar atenção particular à quantidade de água empregue, de modo a prevenir a formação de torrões de composto, que obstruiriam o fluxo do ar no interior da pilha.

Figura: Teste de espremer. Ao espremer um punhado de composto, apenas algumas gotas de água devem aparecer entre os dedos. Neste caso, o teor de humidade é de, aproximadamente, 60 %.

Quando o composto estiver preparado, deverá ser transportado, ou para os sacos ou para as prateleiras nos recintos de cultivo ou para encher os sacos de plástico para o cultivo ou outros recipientes.